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RT-PCR實驗外包,mRNA、miRNA代測

更新時間:2023-06-08   點擊次數:1231次

RT-PCR實驗外包,mRNA、miRNA、lncRNA、DNA實驗代測


服務內容:

1.制定個性化實驗方案:根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內參;
2.檢測類別:mRNA、miRNA、lncRNA、DNA
3.樣本抽提及質檢:對客戶提供樣本進行RNA抽提,并利用NanoDrop進行樣本質檢;
4.定量PCR預實驗:包括樣本反轉錄為CDNA、配置PCR反應體系及進行Real-TimePCR反應;
5.正式定量PCR實驗:根據預實驗結果進行正式實驗;
6.數據分析:采用2- △△CT法進行分析,比較不同樣本間差異。

 


服務要求:
1.請提供組織樣本,細胞樣本,血漿或血清樣本,totalRNA;
2.請提供已知的全長基因序列或GeneBank號;
3.請提供盡可能詳細的背景資料:DNA/RNA來源、基因豐度等。

 

結果內容:整理好的報告,樣本收到之日起5個工作日內反饋質檢結果。

結果展示:

樣本質檢圖



溶解曲線:



擴增曲線


數據統計


每個指標有2張圖。一張是擴增曲線,另一張是熔解曲線,用來證明PCR擴增中無非特異性擴增



送樣運輸要求:


1. 樣品處理


a. 動物組織:常規組織,脂肪組織,結締組織,纖維化組織適當增加。將組織剪切成合適大小后(建議組織塊長寬高均不大于0.5 cm),然后迅速浸泡于5~10倍體積的RNAsolidTM試劑中。(注意:已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經平衡一段時間后,可從溶液中取出,切成更小的組織塊,再重新放回RNAsolidTM試劑中;有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等,不適合用RNAsolidTM試劑進行RNA保護。)


b.植物組織:新鮮的葉、果肉、種子最少100 mg。將嫩葉,嫩莖組織切成合適的大小(建議長寬高均不大于0.5 cm)后,然后迅速浸泡于5~10倍體積的RNAsolidTM試劑中。(注意:某些植物組織天生具有的屏障,如葉子表面的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透,對于此類組織,通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。)


c.細胞等樣本:收集不小于10^6個細胞的沉淀(用PBS清洗1-2次)。之后迅速加入5~10倍體積的RNAsolidTM試劑。


d.酵母、細菌等樣本:離心棄上清,收集小米粒大小的單菌體沉淀,然后迅速加入適量的RNAsolidTM試劑浸沒菌體沉淀。


e. RNA樣品: OD260/280為1.8-2.0,濃度≥100 ng/μL,體積≥20μL,干冰運輸。


f.cDNA:cDNA原液≥20 μL,干冰運輸。


2. 樣品保存及運輸


加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1~2天,2天以后部分組織中的RNA會開始降解。室溫(25℃)穩定保存1周,不會有明顯的RNA降解發生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中,4℃條件下可穩定保存1個月,不會有明顯的RNA降解發生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜,然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去,再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩定保存3~5年。

 

關于Real-time qPCR如何進行數據分析


1. Real-time qPCR常見參數

基線(baseline)

通常是3-15個循環的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值(threshold)

自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設置:置于指數擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果(△Rn=Rn-基線)。

2. 影響Ct值的關鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內,使Ct在15-35之間

反應液成分的影響

任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來,反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復,至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。


另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2,它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準確預測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時,兩個數值之間相關的可信度很好。


標準偏差(standard deviation,偏差的平方根)是的精確度計量方法。

如果許多數據點都靠近平均值,那么標準偏差就小;如果許多數據點都遠離平均值,則標準偏差就大。實際上,足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明,獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態分布。如果PCR反應效率是 100%,那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度,標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大,分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋,標準偏差必須小于等于 0.250


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