信帆生物：單細胞表觀遺傳學研究指南
更新時間：2016-04-28 點擊次數：1157次生物通報道 ：隨著測序成本的直線下降，解讀一個生物的基因組正在逐漸成為研究者們的日常工作。然而，并不是所有細胞都能夠達到測序要求，測序一般需要幾千到一百萬細胞。舉例來說，如果你研究的是早期胚胎發育，那么可用的細胞數量就很少，在這種情況下每一個細胞都很寶貴。
The Scientistzui近撰文詳細介紹了單細胞表觀遺傳學研究中的一些關鍵技術。這些技術可以幫助我們在單個細胞中檢測DNA、組蛋白和染色質水平上的表觀遺傳學修飾。
染色質水平的改變
高等生物的細胞核負責儲存基因組DNA，這些DNA環繞著由四種組蛋白組成的八聚體，形成碟狀的核小體結構?；蚪MDNA以這樣的形式包裝成為染色質，使DNA受到良好的保護。
所有控制基因轉錄的調控蛋白，都要結合在DNA上起作用。而染色質的3D結構會隨著細胞生活周期而變化，調節調控因子所能接觸到的基因。
人們一般使用染色質構象捕獲技術，在細胞群體中研究染色質水平上的改變。但這種技術只能給出平均的3D結構，“你無法了解單細胞的染色質結構，”劍橋大學的Ernest Laue教授說。Laue教授之前參與的一項研究就解決了這個問題，找到了在單細胞中對染色質彎曲和折疊進行定量的方法。這個方法主要是Babraham 研究所的Takashi Nagano開發的，他成功將傳統Hi-C的基礎步驟應用到了單細胞中。研究人員在單個細胞的細胞核中交聯染色質以保持環的形態，用酶消化掉非交聯的染色質，然后連接自由末端并進行測序，在。（延伸閱讀：Nature揭示染色體真實面貌）
進行這樣的微量操作，需要我們在細節處理上一絲不茍。據Laue介紹，目前只有Nagano總能獲得一致性的實驗結果。此外，測序后的計算分析也是這個方法的關鍵所在，因為DNA擴增會帶來許多噪音信號。
揭露組蛋白上的修飾
細胞中的表觀遺傳學改變也發生在組蛋白水平上，比如甲基化、乙酰化和磷酸化。現在人們已經找到了在單細胞中成像組蛋白修飾的方法。美國弗吉尼亞大學的Delphine Gomez和Gary Owens合作，通過熒光探針和原位雜交分析了平滑肌細胞里的組蛋白修飾。他們對鄰位連接檢測進行了改良，利用二抗點亮存在表觀遺傳學修飾的組蛋白。雖然這一方法只能用于固定了的組織，但在不同發育階段對細胞進行檢測，可以揭示隨著時間推移而發生的改變。（原文連接：Nat Methods, 10:171-77, 2013,）
如果你需要檢測活組織中的組蛋白表觀遺傳學修飾，你可以參考Kazuki Sasaki等人開發的檢測技術。這個RIKEN團隊在熒光共振能量轉移FRET的基礎上構建了新型感應器，以監控特定組蛋白殘基上的乙?；Ｋ麄冮_發的探針稱為Histac，主要適用兩種熒光蛋白夾著一個組蛋白和一個能識別組蛋白乙?；匿鍏^結構域(Bromodomain)。當乙?；淮嬖跁r，Histac感應器會生成很強的熒光信號。當組蛋白被乙?；臅r候，構象改變會拉開兩個FRET元件的距離，生成較弱的熒光信號。研究人員用這個技術觀察了有絲分裂過程中的組蛋白乙?；淖?。不過Sasaki等人提醒道，目前這種探針需要向細胞中引入外源組蛋白，有改變細胞基因表達的可能。未來的新一代的Histac探針將會避免這一問題。
前景展望
對于前文提到的單細胞表觀遺學研究方法而言，污染問題都是重中之重，因為這類實驗的樣本和試劑量都很小。如果你的DNA樣本很多，那么擴增步驟通常能蓋過污染。但對于單細胞研究來說，“整個流程的每一步都有可能引入污染，破壞掉真實的信息，”Kelsey說。“我們可以參照二三十年前做PCR時的那些注意事項。”
研究者們普遍認為，單細胞表觀遺傳學領域的下一步發展，是將多種研究方法的結合起來使用。在未來幾個月或者幾年里，我們將會看到能在單個細胞中同時檢測轉錄組和表觀基因組的技術。深入了解更多的單細胞信息，可以幫助人們理解不同細胞之間的差異，以及這些差異對發育或疾病狀態所產生的影響。
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