T細胞亞群檢測試劑盒應該如何正確使用-信帆生物為您答疑解惑
更新時間:2019-12-17 點擊次數:986次T細胞亞群檢測試劑盒應該如何正確使用-信帆生物為您答疑解惑
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T細胞亞群檢測試劑盒說明書
一:試劑盒組成:
1. | 防脫片劑 | 2ml |
2. | 固定液 | 10ml |
3. | A小鼠抗人CD3單抗 | 1ml |
| B小鼠抗人CD4單抗 | 1ml |
| C小鼠抗人CD8單抗 | 1ml |
4. | 生物素標記羊抗小鼠IgG( IgG/Bio) | 3ml |
5. | 堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素(S-A/AP) | 3ml |
6. | A底物增強劑(40×) | 200μl |
| B底物液(40×) | 200μl |
| C底物緩沖液(10×) | 800μl |
7. | 細胞核復染液 | 5ml |
8. | 封片劑 | 1ml |
9. | 記號筆 | 1支 |
10. | PBS | 2包(1000ml) |
二:標本制備:
取肝素抗凝(25μl/ml)的靜脈血1~2ml,PBS稀釋1-2倍后,沿裝有等量淋巴細胞分離液的試管壁混勻緩慢加至液面上層,保持兩種液體界面清晰,離心(2000轉/分)15-20分鐘,吸取兩液面交界處的單個核細胞層,加5倍PBS,離心(1000轉/分)5分鐘,棄上清液,沉淀即為單個核細胞。利用試管中剩余的少許回流液體(約一滴)混勻細胞,制成單個核細胞懸液。滴30μl細胞懸液于載玻片上,靜置2分鐘使細胞下沉粘附于玻片上,吸去液體,快速吹干或37℃溫箱1小時烤干。或用PBS將單個核細胞調至2×105個/ml,離心涂片機1000轉離心1-2分鐘制片,快速吹干或37℃溫箱1小時烤干。涂片前取防脫片劑5-10μl均勻推片,亦可用棉簽粘取防脫片劑均勻涂于干凈玻片上,待干后制備細胞涂片,以防掉片。
三:顯色劑的配制:
分別取A液25ul,B液25ul置于干凈試管中混勻,室溫放置2-5分鐘,加1ml蒸餾水,混勻,再加C液100ul待用。
*使用前,根據所需顯色劑用量,按照以上比例現配現用。
四:標本染色:
1. 充分干燥(室溫2小時以上或過夜)的細胞涂片先用記號筆在標本外畫圈,然后滴加固定液50μl,室溫靜置2-3分鐘,用PBS淋洗,擦干玻片背面及細胞外的PBS。
*以下反應均需在濕盒中進行。
2. 分別滴加抗人CD3、CD4、CD8單抗適量(10-30μl),4℃過夜,PBS淋洗3次。
3. 滴加生物素標記抗小鼠IgG適量(10-30μl),37℃孵育30-45分鐘,PBS淋洗3次。
4. 滴加堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素適量(10-30μl)37℃孵育30-45分鐘,PBS淋洗3次。
5. 滴加顯色劑30-50μl,室溫顯色20-40分鐘。可在顯微鏡下觀察,待細胞膜上出現紅色標記物時,用PBS淋洗。
6. 滴加細胞核復染液30-50μl,30秒后自來水淋洗。
7. 滴加封片劑,蓋片封片,鏡檢。如不需保存亦可用水替代封片劑蓋片鏡檢。
五:觀察:
高倍鏡下選取染色好的視野記數100-200個單個核細胞,細胞表面有紅色標記物為陽性細胞。算出陽性率。
六:正常參考值:
正常人外周血中,陽性細胞百分率一般在:CD3,60-80%;CD4,35-55%;CD8,20-30%;CD4/CD8的比值在1.5-2.0范圍內。
七:儲存條件及有效期:
2-8℃保存,禁止冷凍,有效期為12個月。有效期內可在0-25℃范圍內七天短時運輸。使用時應及時及拿及用,使用后應立即放回冰箱。生物試劑日期,使用期限或失效日期見標簽。
八:注意事項:
1. 免疫細胞化學檢測是一種包含多步驟的檢測方法,試劑的選擇、樣本的處理、涂片的制備、染色及其結果的判讀均需要進行專業的培訓。
2. 任何陽性或陰性的解讀,應由病理科醫生結合病理形態學,表現及其它檢測方法進行,不作為單獨的診斷指標。
3. 復染過度或不足都可能影響結果的判讀。
4. 陰性結果表示未檢出抗原,不一定表示樣本中無該抗原存在,待測抗原編碼基因變異,抗原低表達或抗原修復不當等,都會造成抗原無法檢出。
5. 本試劑僅對經處理的人外周血細胞進行驗證,不做其他用途
6. 試劑盒使用中,應有適當的防護措施,以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。
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