信帆生物開展了:細胞爬片制作培訓活動
更新時間:2020-09-10 點擊次數:827次信帆生物開展了:細胞爬片制作培訓活動
【爬片的準備】
1.爬片可用一般的蓋玻片,也可用爬片;
2.應用蓋玻片,可根據自己的需要剪裁成合適的大小,以備置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪時可用前護士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪,或者是口腔科的那種小沙輪,輕輕劃一下后,稍用力一掰就分開了。
如果接種大皿的話,我一般不將蓋玻片切開,直接清潔后放入培養皿中,到染色時再將之切開,這樣既保證了細胞均一性,又可同時做幾個指標的染色。
3.將剪裁好的爬片,置于濃硫酸中浸泡并過夜,第二天先用自來水沖洗20遍,再置于無水酒清中浸泡6小時,再用三蒸水沖洗3遍(個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了,如果不干凈的話,細胞帖壁不好),放在飯盒或者玻璃培養皿中烘干后進行高壓消毒。
4.高壓后取出放入烤箱中烤干,備用。烤干后可放入超凈臺中。
5.關于多聚賴氨酸,很多人都將玻片用此處理,以使細胞與玻片結合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸,細胞貼壁仍然很好,且在做后續的免疫細胞化學染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。
【細胞爬片】
1.胰酶消化細胞后計數重懸細胞于*培養基中。
2.加細胞時,根據玻片的大小,先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基,目的是使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細胞懸液時玻片漂起,造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。
3.根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養板內即可
4.待細胞貼壁后,可去上清加含藥培養基。
5.按照實驗設計,作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊,張力,我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等這樣時間點的實驗的話,將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續培養。
【細胞爬片的固定】
細胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。當然,根據研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗,因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。
另外在保存細胞爬片的時候,我一般用培養皿或板,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標記,為避免混淆,可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。
以下為常用的固定液
1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。
將純的丙酮預先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心,丙酮在此溫度不會為固體的)細胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強的揮發性,注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴,防止其揮發)固定10分鐘。取出后,室溫吹干,然后放入-20℃保存。
2. 多聚甲醛(常用4%):可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。
主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原,例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等
室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存
3. 95%乙醇,可用于免疫組化。
優點:穿透性強、抗原性保存較好。
缺點:但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差,使蛋白變性的作用輕,固定后可再溶解;染色過程中,溫育時間長,抗原可流失而減弱反應強度
室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存
4. 甲醛(福爾馬林)應用廣
優點:形態結構保存好,且穿透性強,
缺點: 甲醛放置過久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色; 分子間交聯形成的網格結構可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。
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