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檢測各種魚

更新時間:2021-02-08   點擊次數:1259次

檢測各種魚

鱈魚及其制品中裸蓋魚、油魚和南極犬牙魚源性成分檢測
BJS 201907


1 范圍
本方法規定了鱈魚及其制品中裸蓋魚(Anoplopoma fimbria)、油魚(Lepidocybium flavobrunneumRuvettus pretiosus)和南極犬牙魚(Dissostichus eleginoidesDissostichus mawsoni)源性成分的實時熒光PCR檢測方法。
本方法適用于鱈魚、鱈魚片、鱈魚扒等生鮮或速凍鱈魚產品(不包含魚丸、魚糕、魚餅、魚腸、魚豆腐、魚肝油等加工產品)中裸蓋魚、油魚和南極犬牙魚源性成分的定性檢測。
2 原理
使用商業化DNA提取試劑盒,獲得適用于實時熒光PCR檢測的DNA。分別使用裸蓋魚、油魚或南極犬牙魚特異性引物探針,通過實時熒光PCR反應,獲得Ct值,根據Ct值判斷樣品是否檢出裸蓋魚、油魚或南極犬牙魚源性成分。
3 試劑和材料
除另有規定外,本方法中所用試劑均為分析純,水應符合GB/T 6682的一級水要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。
3.1引物探針序列
3.1.1裸蓋魚源性成分NADH2基因
裸蓋魚源成分5 ’端引物:5 ’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3 ’
裸蓋魚源性成分3 ’端引物:5 ’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3 ’
裸蓋魚源性成分探針:5 ’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3 ’
3.1.2油魚源性成分Cytb基因
油魚源性成分5 ’端引物:5 ’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3 ’
油魚源性成分3 ’端引物:5 ’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3 ’ 
油魚源性成分探針:5 ’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3 ’
3.1.3 南極犬牙魚源性成分CK基因
南極犬牙魚源性成分5 ’端引物:5 ’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3 ’
南極犬牙魚源性成分3 ’端引物:5 ’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3 ’
南極犬牙魚源性成分探針:5 ’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3 ’
3.1.4內參照基因真核生物18SrRNA
內參照5 ’端引物:5 ’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ’
內參照3 ’端引物:5 ’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ’
內參照探針:5 ’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3 ’
3.2 商業化DNA提取試劑盒。
3.3 商業化PCR反應預混液。
4 儀器和設備
4.1實時熒光PCR儀。
4.2微量紫外分光光度計。
4.3恒溫水浴鍋。
4.4高速冷凍離心機:離心力18,000 g以上。
4.5微量移液器(0.5 μL- 10 μL,10 μL- 100 μL,20 μL- 200 μL,100 μL- 1000 μL)。
4.6 渦旋振蕩器。
4.7 天平:感量0.001 g。
5 分析步驟
5.1 樣品前處理
(1)樣品只有單塊魚肉組成:使用滅菌剪刀適量剪取中心部位魚肉。
(2)樣品有五塊以下魚肉組成:使用滅菌剪刀適量剪取每個組成部分的中心部位魚肉。
(3)樣品有五塊以上魚肉組成:隨機挑選5塊魚肉,使用滅菌剪刀適量剪取每個組成部分的中心部位魚肉。
將所取得的魚肉使用滅菌去離子水洗滌,離心去除上清液,盡可能剪碎并混勻。
注:速凍鱈魚產品應在*解凍后再取樣。
5.2 DNA提取
按照商業化DNA提取試劑盒說明書中要求的取樣量稱取樣品,每個樣品設置兩個平行,按照商業化DNA提取試劑盒說明書操作。
5.3 DNA濃度測定
取1 μL DNA溶液,使用微量紫外分光光度計按照dsDNA(雙鏈DNA)計算方式檢測其濃度。
5.4 實時熒光PCR擴增
實時熒光PCR反應體系見表1。
 

PCR反應程序:95 ℃ 15 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s(讀取熒光),40個循環。
5.5 實驗對照
分別設置陽性對照、陰性對照、PCR空白對照、空白提取對照各一個。
陽性對照:含相應物種的DNA。
陰性對照:不含相應物種的DNA。
PCR空白對照:以滅菌去離子水替代DNA加入實時熒光PCR反應體系。
空白提取對照:以滅菌去離子水替代樣品進行DNA提取。
6 結果判斷與表述
6.1 質量控制
若以下條件的其中一條不滿足要求時,結果視為無效:
陽性對照:熒光通道出現典型的擴增曲線,相應的Ct值<30.0;
陰性對照:Ct值≥35.0;
PCR空白對照:Ct值≥35.0;
  空白提取對照:Ct值≥35.0;
內參照反應:熒光通道出現典型的擴增曲線,相應的Ct值<30.0;
樣品平行反應:Ct值經6.2結果判定后應一致。
6.2 結果判定
(1)如Ct值<30.0,且質量控制符合要求,則判定為檢出相應物種源性成分。
(2)如Ct值≥30.0,且質量控制符合要求,則判定為未檢出相應物種源性成分。
6.3 結果表述
檢出 XXX 源性成分。
未檢出 XXX 源性成分。
7 防污染措施
檢測過程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的規定執行。
8 方法檢出限
裸蓋魚引物探針檢出限范圍為0.1 %~5 %,油魚引物探針檢出限范圍為1 %~10 %,南極犬牙魚引物探針檢出限范圍為1 %~2 %。
注:因使用的設備、試劑盒不同,其檢出限有所差異。
 

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