測(cè)定意義： LPS又稱甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和單酯）。LPS廣泛的存在于各種生物中。血清中LPS的異常增高常見于胰腺炎和胰腺癌。 測(cè)定原理： LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用銅皂法測(cè)定脂肪酸生成速率，即可計(jì)算LPS活性。 自備儀器和用品： 研缽、臺(tái)式離心機(jī)、震蕩混勻器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、甲苯、無水乙醇、冰和蒸餾水。 試劑組成和配制： 試劑一：液體×2瓶，4℃保存。 試劑二：液體×1瓶，室溫保存。 試劑三：液體×1瓶，4℃保存。 標(biāo)準(zhǔn)品×1瓶，10 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫保存。臨用前加入3.168 mL無水乙醇，充分溶解。 粗酶液提取： 稱取約0.1g樣品，加試劑一1 mL充分研磨，16000rpm 4℃離心40min，取上清液待測(cè)。 LPS測(cè)定操作： - 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到710 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一和試劑二置于37℃水浴預(yù)熱30min以上。 3. 空白管：取1.5 mL EP管，依次加入150μL試劑一和50μL試劑二，反復(fù)震蕩混勻；加入5μL蒸餾水，迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min；加入400μL甲苯，反復(fù)震蕩混勻后，室溫4000rpm離心10min；取出離心管，小心吸取上層溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50μL試劑三，反復(fù)震蕩混勻；室溫4000rpm離心10min，小心吸取上層溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測(cè)定吸光值。記為A空白管。 4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1.5 mL EP管，依次加入150μL試劑一和50μL試劑二，反復(fù)震蕩混勻；加入5μL標(biāo)準(zhǔn)品，迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10min；加入400μL甲苯，反復(fù)震蕩混勻后，室溫4000rpm離心10min；取出離心管，小心吸取上層溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50μL試劑三，反復(fù)震蕩混勻；室溫4000rpm離心10min，小心吸取上層溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測(cè)定吸光值。記為A標(biāo)準(zhǔn)管。 5. 測(cè)定管：取1.5mL EP管，依次加入150μL試劑一和50μL試劑二，反復(fù)震蕩混勻；加入5μL上清液，迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10min；加入400μL甲苯，反復(fù)震蕩混勻后，室溫4000rpm離心10min；取出離心管，小心吸取上層溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50 μL試劑三，反復(fù)震蕩混勻；室溫4000rpm離心10 min，小心吸取上層溶液150 μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm處測(cè)定吸光值。記為A測(cè)定管。 LPS活性計(jì)算： a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下 （1）按蛋白濃度計(jì)算 活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（Cpr×V樣÷V樣總) ÷T=0.1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷Cpr （2）按樣本鮮重計(jì)算 活性單位定義：37℃中每克樣品每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鮮重) =[ V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=0.1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W C標(biāo)準(zhǔn)品：10 µmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：加入反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.005 mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，205μL=2.05×10-4L；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.005 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10 min。 b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下 （1）按蛋白濃度計(jì)算 活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（Cpr×V樣÷V樣總) ÷T=0.1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷Cpr （2）按樣本鮮重計(jì)算 活性單位定義：37℃中每克樣品每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鮮重) =[ V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=0.1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W C標(biāo)準(zhǔn)品：10 µmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：加入反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.005 mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，205μL=2.05×10-4L；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.005 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10 min。 注意事項(xiàng)： 1、甲苯有毒，實(shí)驗(yàn)過程中需佩戴手套和口罩。 2、實(shí)驗(yàn)過程中須遠(yuǎn)離火源。 |
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