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脂氧合酶活性測定試劑盒說明書

點擊次數(shù):706 發(fā)布時間:2021/6/2
提 供 商: 信帆生物 資料大小:
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脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)活性測定試劑盒說明書
分光光度法 50 /24
注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
LOX 廣泛存在于動植物組織中,催化不飽和脂肪酸氧化反應,導致膜脂過氧化。在生物體
的生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。
測定原理:
LOX 催化亞油酸氧化,氧化產(chǎn)物在 280nm 處有特征吸收峰;測定 280nm 吸光度增加速率,
來計算 LOX 活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL
試劑一)進行冰浴勻漿。16000g4離心 20min,取上清置冰上待測。
測定:
1. 分光光度計預熱 30 min,調(diào)節(jié)波長到 280nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 在試劑三中加入 25mL 試劑二(振蕩混勻 1min),在 30℃水浴中預熱 10 min 以上。用不
完的試劑 4℃保存。
3. 對照管:依次在 1mL
石英比色皿中加入
100μL
樣本和
900μL
試劑二,30℃反應
30min
后,記錄 A 對照。
4. 測定管:依次在 1mL
石英比色皿中加入
100μL
樣本和
900μL
試劑三,30℃反應
30min
后,記錄 A 測定。
5. ΔA=A 測定-A 對照
LOX 活性計算公式:
1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化 0.01 個單位為 1 個酶活單位。
LOX (U/mg prot) =ΔA×V 反總÷(Cpr×V )÷T×100
= 33.33×ΔA÷Cpr
2)按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化 0.01 個單位為 1 個酶活單位。
LOX (U/g 鮮重) =ΔA×V 反總÷(W×V ÷V 樣總)÷T×100
= 33.33×ΔA÷W
Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,需另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;
V 樣:加入反應體系中上清液體積,100μL=0.1mLV 反總:反應總體積,1mLV 樣總:
上清液總體積,1mLW:樣本質(zhì)量,gT:反應時間,30min

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