信帆生物科技有限公司代理銷售“細胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑盒"，現貨供應，歡迎。CAMKII激酶活性檢測試劑盒說明書。
細胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
本所細胞CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到CAMKII磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中CAMKII活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中CAMKII激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。
技術背景
Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases；CAMK；EC2.7.11.17）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一，主要由Ca2+/鈣調素復合物調控，在細胞分裂和分化、神經傳導介質分泌、轉錄因子調節、糖原代謝、肌肉收縮、記憶、心功能等方面發揮作用。在大多數組織中表達，尤其在神經組織中高度表達。功能分類為特異型，其代表為肌凝蛋白輕鏈蛋白激酶（myosin light chain kinase；MLCK）和多功能型，其代表為Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II；CAMKII）。亞型分類為I型、II型、和IV型。亞體分類為α、β、γ、δ四種。Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶有3個結構域：N端催化域（catalytic）、中央調節域（regulatory，包含自發抑制域——autoinhibitory domain；AID和Ca2+/鈣調素結合中心），和C端協同域（association），Ca2+/鈣調素復合物激活CAMK后，產生自發性自我磷酸化。Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II主要作用于中樞神經系統，調節細胞內鈣離子瞬時變化，誘導長時程增強（potentiation）、突觸可塑性（synaptic plasticity）、神經傳導介質合成和釋放、與記憶和學習功能相關。其磷酸化目標序列為KKALRRQETVDAL。基于底物KKALRRQETVDAL，在ATP的存在下，受到Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II的活性。其反應方式為：
產品內容
本所清理液（Reagent A） 毫升 本所裂解液（Reagent B） 毫升 本所緩沖液（Reagent C） 毫升 本所酶促液（Reagent D） 微升 本所反應液（Reagent E） 微升 本所底物液（Reagent F） 微升 本所陰性液（Reagent G） 微升 產品說明書 1份
保存方式
保存本所清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月
用戶自備
CAMKII激酶：用于抑制劑篩選 1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器 15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器 細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離 （微型）臺式離心機：用于樣品預處理 100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器 分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析
實驗步驟
- 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 107細胞）
- 小心加入xx毫升本所清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
- 小心抽去清理液
- 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
- 加入xx毫升本所清理液（Reagent A），混勻細胞
- 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
- 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升本所裂解液（Reagent B），充分混勻
- 轉移到預冷的1.5毫升離心管
- 強力渦旋震蕩15秒
- 置于冰槽里孵育30分鐘
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用本所 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
- 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里
- 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零
- 本所緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
- 移取xx微升本所緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升本所陰性液（Reagent G）
- 放進30℃培養箱里靜置10分鐘
- 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升本所反應液（Reagent E）
- 加入xx微升本所底物液（Reagent F）
- 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘
- 移取xx微升本所緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）
- 放進30℃培養箱里靜置10分鐘
- 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升本所反應液（Reagent E）
- 加入xx微升本所底物液（Reagent F）
- 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘
- 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
- 分別移取xx微升本所緩沖液（Reagent C）到96孔板里
- 分別加入xx微升本所陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
- 在30℃溫度下孵育10分鐘
- 分別加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
- 分別加入xx微升本所反應液（Reagent E）
- 分別加入xx微升本所底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動96孔板
- 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
- 活性計算：
七、抑制劑篩選
- 在96孔板上做好相應標記：背景、*活性和待測抑制劑樣品
- 按下表加入試劑，進行樣品預處理
內容物 | 空背景對照 | 樣本背景 | *酶活性 | 待測抑制劑酶活性 | 本所緩沖液（Reagent C） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 | 本所陰性液（Reagent G） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— | 待測抑制劑 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 | 用戶自備的純化酶 | —— | —— | xx微升（1毫單位） | xx微升（1毫單位） | 96孔板每孔總量 | 空背景對照孔 （xx微升） | 樣本背景孔 （xx微升） | *活性孔 （xx微升） | 待測抑制劑樣品孔 （xx微升） | 輕輕搖動96孔板，混勻，放進30℃培養箱里孵育15分鐘 |
- 分別加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
- 分別加入xx微升本所反應液（Reagent E）
- 分別加入xx微升本所底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動96孔板
- 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘
- 抑制活性計算：
注意事項
- 本產品為25次操作，包括背景操作
- 操作時，須戴手套
- 系統操作過程中，背景測定只需1次
- 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
- 樣品須澄清，至關重要
- 啟動反應后3秒內即刻光度測定
- 測定值由高到低變化；測定可持續30分鐘
- 光度測定后，比色皿須清洗*
- 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 本所 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
- 可以使用CAMKII抑制劑（KN-93；IC50=370納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
- Ca2+/鈣調素依賴型蛋白激酶II活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品
質量標準
使用承諾
公司秉著“信譽、客戶滿意、質量承諾"的宗旨為我們的用戶提供產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。
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