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人轉(zhuǎn)化生長因子B1(TGF-B1)試劑盒操作說明書下載

點(diǎn)擊次數(shù):1341 發(fā)布時(shí)間:2015/6/23
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人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫分析 試劑盒使用說明書 *部分 ELISA簡介 ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。自上世紀(jì)70年代初問世 以來,發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用 于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測定時(shí),受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測定方法達(dá)到很高的敏感度。 第二部分 ELISA 的樣本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 在收集樣本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃,必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的樣本,及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆谩τ诟籼煸贆z測的樣本,及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆茫袟l件的,-70℃凍存?zhèn)溆谩?biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。 液體類標(biāo)本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。
2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。
5. 培養(yǎng)細(xì)胞:檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
6. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),或組織蛋白萃取試劑,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
7. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)
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行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
8. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
第三部分 ELISA試劑盒的檢測目的和實(shí)驗(yàn)原理 1.檢測目的 本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)含量。 2.實(shí)驗(yàn)原理 本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平。用純化 的人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中 依次加入轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1),再與 HRP 標(biāo)記的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗 體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)濃度。 第四部分 試劑盒組成
試劑盒組成
48T
96T
保存
說明書
1份
1份
封板膜
2片(48)
2片(96)
密封袋
1個(gè)
1個(gè)
酶標(biāo)包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品:(2000 ng/L)
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1.5ml×1瓶
1.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶標(biāo)試劑
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑A液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑B液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
濃縮洗滌液
(20倍)20ml×1瓶
(30倍)20ml×1瓶
2-8℃保存
第五部分 操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀 釋。
1000 ng/L
5 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
500 ng/L
4 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
250 ng/L
3 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
125 ng/L
2 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
62.5 ng/L
1 號標(biāo)準(zhǔn)品
150μl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
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2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl, 然后再加待測樣品 10μl(樣品zui終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡 量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此
重復(fù) 5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同 3。
8. 洗滌:操作同 5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止:每孔加終止液 50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
12. 操作程序總結(jié):
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第六部分 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的 OD 值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù), 即為樣品的實(shí)際濃度。 (此圖僅供參考) 第七部分 注意事項(xiàng) 1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未 用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 2.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間 控制在 5 分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,使用排槍加樣。 4. 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本 OD 值 大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n 倍)后再測定,計(jì) 算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。 5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。 6.底物請避光保存。 7.嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 9.本試劑不同批號組分不得混用。 第八部分 檢測范圍 40ng/L-1000ng/L 第九部分 保存條件及有效期 1.試劑盒保存:
2-8℃ 2.有效期:6 個(gè)月

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