丙酮酸(pyruvic acid PA)檢測試劑盒說明書下載
測定意義:
丙酮酸通過乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。 測定原理: 丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在堿性溶液中呈櫻紅色。 需自備的儀器和用品: 可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。 試劑的組成和配制: 提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 5mL×1 瓶, 4℃保存; 試劑二:液體 25mL×1 瓶, 4℃保存。 丙酮酸提取: 1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量 (104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提 取液),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次),靜置 30min, 8000g,常溫離心 10min,取上清待測。 2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織, 加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿,靜置 30min,8000g,常溫離心 10min,取上清待測。 3、血清(漿)樣品:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建 議取 0.1mL 血清(漿)加入 1mL 提取液),進行冰浴勻漿,靜置 30min, 8000g,常溫離心 10min,取上清待測。 測定步驟: 1、 分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 520nm,蒸餾水調零。 2、取 300μL 樣本+100μL 試劑一于 1.5mL EP 管中,混勻,靜置 2min,加入 500μL 試劑二, 混勻,于 520nm 波長處測定管吸光值 A。 丙酮酸含量計算: 1、標準條件下測定回歸方程為 y = 0.0466x + 0.0675; x 為丙酮酸鈉含量(μg/mL),y 為吸 光值。 2、按照血清(漿)體積計算 丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V3×V1÷V2)=214.6×(A-0.0675) 3、按照蛋白濃度計算 丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr 4、按照樣品質量計算 丙酮酸含量(μg/g 鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2)=21.46×(A-0.0675) ÷W 3、按照細菌或細胞密度計算 丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(500×V1÷V2)=0.043×(A-0.0675) V1:加入反應體系中樣本體積,0.3mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿) 體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數, 500 萬。
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