基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/9明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒說明書下載 MMP Zymography Assay Kit 750T 1. 簡(jiǎn)介: 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程,其在診斷和治療中的意義日益受到重視。 2. 檢測(cè)原理: 本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,其靈敏度可達(dá)1 nM,高于ELISA方法,其基本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區(qū)域,從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性,檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),如果小膠加樣孔為10~15個(gè),則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。 3. 檢測(cè)目的: 本試劑盒用于檢測(cè)MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM)。 4. 試劑盒組成與儲(chǔ)存: A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC; B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC; C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋; D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋; E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液, 4 ºC。 5.檢測(cè)步驟: 5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。 5.2 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。 陽性對(duì)照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。 注:因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低,的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽性對(duì)照 5.3 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。 5.4 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。 5.5 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽性對(duì)照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低,應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過夜。 5.6 顯色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。 透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。 5.7 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。 6.說明: 1. 10 mM 能夠EDTA*抑制MMP活性。 2. 凝膠干燥:可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠,作為*記錄保留。 7.參考文獻(xiàn): 1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494 2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,1980, 102,196–202 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書 常規(guī)考馬斯亮藍(lán)SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高,但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。 染色步驟: 1. 此染色液即為工作液,使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝 膠,并緩慢搖動(dòng)2h; 2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠; 3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動(dòng)2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,直至獲得清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景(通常此過程需要2~4h,也可脫色過夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景); 4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對(duì) 凝膠進(jìn)行處理后保存。 安全性:含有甲醇,無特殊毒性,按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。 說明: 1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍(lán)R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至1000ml,混合1h 后用 Whatman 1 號(hào)濾紙過濾,于室溫可無限期保存; 2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V); 3. 保存液:7%冰醋酸; 4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),室溫或4 ºC 保存,可反復(fù)使用2-4 次。 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/9明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒說明書下載 |