果糖磷酸激酶活性測(cè)定試劑盒

（6-phosphofructokinase，分光光度法 50T/48 樣）

一、測(cè)定意義

果糖磷酸激酶（PFK）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物

和培養(yǎng)細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)換為果糖-1,6-

二磷酸和ADP，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

二、測(cè)定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和

ADP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化

生成NAD+，在340 nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反應(yīng)PFK

活性。

三、自備儀器用品

離心機(jī)、紫外分光光度、水浴鍋、1mL石英比色皿、移

液槍、研缽、冰和蒸餾水

四、試劑組成和配制

提取液：60mL×1 瓶, 4℃保存

試劑一：40mL×1 瓶，4℃保存

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存，臨用前加2.8mL蒸餾水充

分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復(fù)凍融

試劑三：粉劑×1 支，4℃保存，臨用前加0.26mL蒸餾水充

分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復(fù)凍融

試劑四：液體×1 支，4℃保存，臨用前加0.26mL蒸餾水充

分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存不能反復(fù)凍融

五、樣品前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心

后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4個(gè)）：提取液體積

（mL）500-1000：1的比例（建議1000萬細(xì)菌或細(xì)胞加

入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率

20％或200W，超聲3s，間隔10 秒，重復(fù)30 次）；在4°C

下8000g離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)1：5~10 的

比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰

浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)

六、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，用蒸餾

水調(diào)零。

2. 工作液（可測(cè)25個(gè)樣）的配置：取19mL試劑一和1.26mL

試劑2充分混勻；用不完的試劑4℃保存一周。

3. 將工作也置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱

10min。

注意：不同勻漿組織中PFK活性不一樣，做正式試驗(yàn)

之前請(qǐng)做1-2只預(yù)實(shí)驗(yàn)，若△A>0.5，則說明活力太高，

必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式

中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時(shí)間至2min或

5min，使得△A<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。

七、PFK活性計(jì)算

1、血清（漿）活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL 血清（漿）在每分鐘催化1nmol果糖

-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖-1,6-二

磷酸和1nmolADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFK(U/mL) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷V ÷T

=450×△A

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計(jì)算

（1）.按組織蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-

磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖-1,6-

二磷酸和1nmolADP定義為一個(gè)酶活力

單位。

PFK(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(Cpr×V樣)÷T

=450×△A÷Cpr

（2）.按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和

1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖-1,6-二磷酸

和1nmolADP定義為一個(gè)酶活力單位。

PFK(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(W×V 樣÷V樣總)÷T

=450×△A÷W

（3）. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol果

糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)換為1nmol果糖

-1,6-二磷酸和1nmolADP定義為一個(gè)酶

活力單位。

PFK(U/mg) = [△A×V反總÷(ε×d)×10 9]÷(1000×V樣÷V樣總)÷T

=0.45×△A

ε：NADH在340nm 處摩爾吸光系數(shù)為6.22×10 3L/mol/cm；

d ：比色皿光徑（cm），1cm；

V反總：反應(yīng)體系總體（L），840μL=8.4×10 -4L；

10 9：1mol=1×10 9nmol；

Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）

V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），30μL=0.03mL；

V樣總：加入提取液體積，1mL

T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

W，樣本質(zhì)量，（g）

1000： 細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，1000萬。

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