免疫組化實驗代測，IHC實驗技術服務，免疫組化操作步驟
　

　一 免疫組化（LP 法）操作步驟

　　1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步后進行

　　⒉ 緩沖液洗 3min/2 次。

　　⒊ 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

　　⒋ 緩沖液洗 5min/2 次。

　　⒌ 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

　　（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

　　⒍ 緩沖液洗 5min/2 次。

　　⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者zui終決定）

　　⒏ 緩沖液洗 5min/2 次。

　　9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鐘。

　　10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

　　11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鐘。

　　（注：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。）

　　12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

　　13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）

　　14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

二．免疫組化主要步驟
1. 洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從而產生吸附作用。
2. 包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，zui后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。
3.切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向*，然后調節切片的厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4. 撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向*，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5. 脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.
6.抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8. 加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過一夜。
9. 加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
10. 加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11. 加顯色劑：將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）

 A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液
12. 復染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13. 脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，zui后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。
14. 封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側，然后輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。

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三. 免疫組化染色步驟

　　冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。

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四：如何實現*的免疫組化實驗 
 
1 ．固定 ：用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原 ，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而的固定液，請于購置前注意說明書。
Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原 有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的保存。 PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。

2 ．組織脫水，透明 ：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。

3 ．切片時展片： 有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。

4 ．烤片： 60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原 容易丟失。

5 ．蠟塊及切片的保存： 在4℃保存

6 ．脫片問題 ： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化 染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進行下一步。

7 ．滅活內源性酶： HRP系統：3%雙氧水滅活；AP系統：3%HAc滅活。

8 ．暴露抗原 ： 對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的修復液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9 ．封閉： 在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉

10 ．抗體稀釋： 應遵循“現用現配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用。

11 ．背景高： 在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。

12 ．返藍： 在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。

13 ．顯色： 一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
14． 在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。

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