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                                          real-time PCR實驗檢測

Real-Time PCR 技術，又稱實時定量熒光PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。

服務說明

熒光定量PCR實驗步驟

1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預冷。

2）取100mg組織，加入到勻漿器中。

3）充分研磨直至無可見組織塊。

4）13000g離心10min取上清。

5）加入250 μl，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。

6）4℃下13000g離心8min。

7）將上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。

10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。

11）4℃下13000g離心5min。

12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。

13）加入20μl無RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

2、反轉錄（槍頭和PCR均經過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl oligo(dT)15。

3）用無核糖核酸酶的去離子水補足至12μl。

4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。

5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉錄酶，用槍抽吸混勻。

6）于PCR儀上42℃保溫60min，結束后80℃保溫5min滅活反轉錄酶。

3、定量PCR

1）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管。

2× qPCR Mix  12.5μl

7.5μM基因引物 2.0μl

反轉錄產物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

2）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管。

2×qPCR Mix  12.5μl

7.5μM內參引物 2.0μl

反轉錄產物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

3）PCR擴增

預變性    95℃，10min

循環（40次）      95℃，15s→60℃，60s

溶解曲線   75℃→95℃，每20s升溫1℃

4、結果處理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內標基因，待測樣本)

B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內標基因，對照樣本)

K=A-B

表達倍數=2-K

real-time PCR實驗檢測

注意事項

1、長度：15—30bp。 

2、G十c含量：應在40%一60%之間。

3、堿基分布的隨機性

4、引物自身：不要含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構。

5、引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。

6、上下游引物的互補性：一個引物的3‘末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。

7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應為G或C。

8、設計RT-PCR的引物時，上下游引物要跨內含子，以消除基因組DNA的干擾。

9、引物設計好后再NCBI上進行序列比對，檢查是否可能有錯配產物擴增。

10、引物設計要注意種屬。