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細胞核蛋白和胞漿蛋白制備試劑盒

操作步驟：

1. 裂解：(1) 培養細胞，PBS洗滌細胞兩次，根據細胞計數，或者估計離心后的細胞體積PCV。每1 ×10⁶個細胞加入50~100ul的CEB-A，刮下細胞轉移至預冷的1.5ml離心管；或者每體積PCV細胞加入5倍PCV體積的CEB-A (即10~20 ml PCV的細胞加50~100ul的CEB-A)，劇烈振蕩重懸。

裂解: (2) 組織樣本，精確稱重后剪成小塊，PBS洗滌。通常每10 mg動物組織相當于1×10⁶個細胞，需加入50~100ulCEB-A，參照上表按比例加入。在冰上使用玻璃勻漿器勻漿組織，通常需要20~40次上下抽動勻漿，棄去筋膜組織。切記勿用高速電動勻漿器或超聲破碎組織避免破壞細胞器結構。

2.  裂解產物轉移至預冷的1.5ml離心管，劇烈振蕩30秒，冰浴10~15min，期間每5分鐘振蕩15秒。

3. 可選步驟：根據步驟2裂解物體積，加入1/20體積的CEB-B，振蕩10秒，冰浴1min (加入CEB-B可去除部分核膜蛋白，適于制備高純度的核蛋白用于EMSA凝膠阻滯實驗等，但可使胞漿蛋白出現很少量的膜蛋白污染。若制備高純度胞漿蛋白可跳過此步驟。若制備核蛋白僅用于普通的Western Blot目的，則無須高純度核蛋白，也可省略此步驟。

4.  胞漿蛋白組分的制備：將步驟2或步驟3的上清，12000g 4 ^oC離心5min，勿觸動沉淀，將上清轉移到新管，此即胞漿蛋白組分，可立即使用或−20~−70ºC保存。

5. 胞核粗提組分的制備：取第步驟4的原離心管，12000g 4 ^oC瞬時離心，盡量吸除上清，保留沉淀。加入100μl CEB-A和5μl  CEB-B，振蕩10秒，重懸沉淀，冰浴1min，1000g 5min，棄上清。再次加入100μl CEB-A和5 μl CEB-B重懸沉淀冰浴1min，1000g 5min，盡棄上清，保留沉淀。

6.   胞核蛋白的制備：加50~100μl預冷NEB重懸步驟5的離心沉淀，劇烈振蕩15秒，冰上30min，期間每10 min振蕩15秒。12000g 5min，上清液含核蛋白成分，其中含有25%的甘油；可立即使用或−20~−70ºC保存。

細胞核蛋白和胞漿蛋白制備試劑盒