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1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒

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1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒,是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶,既控制著 CO2的固定,同時(shí)又制約著碳素向 Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,其活性的大小直接影響著光合速率。

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1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒

( 貨號(hào): A151-1-1 分光光度法 25 /24 )

一、測(cè)定意義:

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個(gè)關(guān)鍵酶,既控制著 CO2的固定,同時(shí)又制

約著碳素向 Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,其活性的大小直接影響著光合速率。

二、測(cè)定原理:

Rubisco 的催化下,1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP) 1 分子的 CO2結(jié)合,產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸

甘油酸(PGA)PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸,

并使還原型輔酶(NADH)氧化。因此,340nm 吸光度的變化可計(jì)算還原型輔酶Ⅰ氧化速率,還原型輔酶

Ⅰ氧化速率可反映 Rubisco 的活性。

三、自備的儀器和用品:

可見-紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

四、試劑的組成和配制:

提取液一:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;

提取液二:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一30mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加入 12.5mL 試劑一,充分混勻備用,用不完的試劑分裝后-20

保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑三:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加入 12.5mL 試劑一,充分混勻備用,用不完的試劑分裝后-20

保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑四:粉劑×1 瓶,-20℃保存,臨用前加入 1.25mL 試劑一,充分混勻備用,用不完的試劑分裝后-20

保存,禁止反復(fù)凍融;

(注意:試劑二、三、四溶解后,按需分裝-20℃保存。)

五、樣本的前處理:

1 Rubisco 酶提取:建議稱取約 0.1g 樣本,加入 1mL 提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W

破碎 3s,間歇 7s,總時(shí)間 1min),然后 4℃,8000g 離心 10min,取上清測(cè)定。

2胞漿和葉綠體 Rubisco 酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5-10 的比例(建議

稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液一),冰浴勻漿后于 4℃,200g 離心 5min,分離并保留沉淀,取上

清在 4℃,8000g 下離心 10min,取上清用于測(cè)定胞漿 Rubisco 酶活性;取沉淀加 1mL 提取液二,震蕩

溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎 3s,間歇 7s,總時(shí)間 1min),然后 4℃,8000g 離心 10min,取

上清測(cè)定葉綠體中 Rubisco 酶活性。

建議測(cè)定總 Rubisco 酶活性,按照步驟 1 提取粗酶液,若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 Rubisco,則按照

步驟 2 提取粗酶液。(注意:粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。)

六、測(cè)定步驟

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定:

1)工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三 1:1 混合,用多少配多少;

2)在 1mL 石英比色皿中,加入 50μL 樣本、50μL 試劑四和 900μL 工作液,立即混勻,記錄 340nm

20s 時(shí)吸光值 A1 5min20s 時(shí)的吸光值 A2,計(jì)算A=A1-A2

七、Rubisco 活性計(jì)算:

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算(此法需要測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)濃度,建議選購(gòu)本公司生產(chǎn)的 BCA 法蛋白濃度

測(cè)定試劑盒)

單位的定義:25℃中 1mg 蛋白 1min 氧化 1nmolNADH 為一個(gè)酶活力單位。

Rubisconmol/min/mg prot=[A×V 反總÷ε×d×10 9V ×Cpr÷T

=643×A÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:25℃中 1g 組織 1min 氧化 1nmolNADH 為一個(gè)酶活力單位。

Rubisconmol/min/g 鮮重)=[A×V 反總÷ε×d×10 9V ÷V 樣總×W÷T

=643×A÷W

上述計(jì)算公式中各符合含義:

V 反總:反應(yīng)體系總體積,1×10 -3 L

εNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×10 3 L/mol/cm

d:比色皿光徑,1cm V :加入樣本體積,0.05mL

V 樣總:加入提取液體積 1mL

T:反應(yīng)時(shí)間,5min Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL W:樣本質(zhì)量,g

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)試劑盒 

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