微量分型巰基測(cè)試盒 生化試劑
- 型 號(hào):
- 參考價(jià):0~0
微量分型巰基測(cè)試盒,5,5’-二硫代雙,2-硝基苯甲酸(DTNB)與巰基化合物反應(yīng)時(shí)能產(chǎn)生一種黃色化合物,可進(jìn)行比色定量測(cè)定。
微量分型巰基測(cè)試盒
(酶標(biāo)微板法)
一、試劑的組成與配制:(24T)
試劑一:標(biāo)準(zhǔn)品粉劑,3 支,4℃密封保存 6 個(gè)月。
10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的配制:每次測(cè)定前將 1 支標(biāo)準(zhǔn)品
粉劑加 1mL 試劑三-緩沖液溶解,即為 10mmol/L
標(biāo)準(zhǔn)品貯備液,4℃密封保存。
500μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品∶試劑
三緩沖液=1∶19 即 20 倍稀釋配成應(yīng)用液,按所
需量現(xiàn)用現(xiàn)配。
試劑二:透明劑,2mL×1 瓶,4℃密封保存 12 個(gè)月(天冷
時(shí)會(huì)凝固,每次測(cè)試前適當(dāng)水浴加溫以加速溶解,
直至透明方可應(yīng)用)。
試劑三:緩沖液,20mL×1 瓶,4℃密封保存 6 個(gè)月。
試劑四:顯色劑,3mL×1 瓶,4℃避光保存 6 個(gè)月。
工作液一的配制:按透明劑∶緩沖液∶顯色劑=1∶50∶25
的比例混合,用多少配多少。
工作液二的配制:按透明劑∶緩沖液=1∶75 的比例混合,用
多少配多少。
注:按所需檢測(cè)的樣本數(shù)加上標(biāo)準(zhǔn)孔及標(biāo)準(zhǔn)空白孔的數(shù),
再放寬 2 孔進(jìn)行工作液的配制(避免吸到最后試劑
量不夠)。工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配,最多可保存 1~2 天。
試劑五:沉淀劑,10mL×1 瓶,室溫保存 6 個(gè)月(過(guò)飽和溶
液,如有結(jié)晶析出,直接取上清使用)。
96 孔板:一塊(本公司贈(zèng)送)。
二、操作步驟:
1、血清(漿)樣本前處理:
①、總巰基:
直接取樣進(jìn)行測(cè)定。
②、非蛋白巰基:
待測(cè)樣本:取血清(漿)50μL,加入 150μL 試劑五
沉淀劑(也可按照樣本:試劑五=1:3
比例上下調(diào)整),充分混勻 3500-4000
轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘,取上清 10μL 待測(cè);
待測(cè)標(biāo)準(zhǔn):取 500μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 50μL,加
入 150μL 試劑五沉淀劑,充分混勻后取
10μL 待測(cè)(此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度為
125μmol/L)
2、動(dòng)、植物組織、培養(yǎng)細(xì)胞前處理:
動(dòng)物組織:準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)動(dòng)物組織的重量,按重量體
積比(動(dòng)物組織︰生理鹽水=1g︰9mL),將動(dòng)物
組織剪碎后加生理鹽水用勻漿機(jī)或勻漿管制備成
10%的動(dòng)物組織勻漿,2500~3000 轉(zhuǎn)/分,離心 10
分鐘取上清(即 10%組織勻漿)待測(cè)。
植物組織:準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)植物組織的重量,按重量體
積比(植物組織︰0.1mol /L pH7~7.4 磷酸鹽緩
沖液=1g︰9mL),將植物組織剪碎后加 0.1mol/L
pH 7~7.4 磷酸鹽緩沖液用勻漿機(jī)或勻漿管制備成
10%的植物組織勻漿,3500~4000 轉(zhuǎn)/分,離心 10
分鐘取上清(即 10%組織勻漿)待測(cè)。
培養(yǎng)細(xì)胞:將細(xì)胞進(jìn)行胰-酶消化(也可將細(xì)胞直接刮
下),取出細(xì)胞及液體放入試管,1000 轉(zhuǎn)/分~3000
轉(zhuǎn)/分,離心 5 分鐘,棄上清,留沉淀細(xì)胞,再加
入 1mL 生理鹽水輕輕吹打混勻(將胰-酶及部分培
養(yǎng)液洗去),1000 轉(zhuǎn)/分~3000 轉(zhuǎn)/分,離心 5 分鐘,
棄上清,留沉淀細(xì)胞加入 0.2~0.3mL 的生理鹽水
進(jìn)行勻漿(勻漿的方法有多種:例如①
加細(xì)胞裂
解液裂解細(xì)胞;② 在冰水浴下超聲粉碎細(xì)胞;③
手動(dòng)勻漿管進(jìn)行勻漿;④ 在冰水浴下用卡富隆電
動(dòng)玻璃勻漿器電動(dòng)研磨,每次 5~10 秒,間隔 20
秒,總共研磨 3~4 次),取勻漿液待測(cè)。
①、總巰基:直接取樣進(jìn)行測(cè)定。
②、非蛋白巰基:
待測(cè)樣本:取勻漿 50μL,加入 150μL 試劑五沉淀劑
(也可按照樣本:試劑五=1:3 比例上
下調(diào)整),充分混勻,3500-4000 轉(zhuǎn)/分
離心 10 分鐘,取上清 10μL 待測(cè);
待測(cè)標(biāo)準(zhǔn):取 500μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 50μL,加
入 150μL 試劑五沉淀劑,充分混勻后取
10μL 待測(cè)(此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度為
125μmol/L)。
四、測(cè)定原理:
5,5’-二硫代雙,2-硝基苯甲酸(DTNB)與巰基化合
物反應(yīng)時(shí)能產(chǎn)生一種黃色化合物,可進(jìn)行比色定量測(cè)定。
五、所需儀器:
單道移液器:可進(jìn)行單孔的加樣工作
多道移液器:可進(jìn)行 8 或 12 孔的加樣工作
酶標(biāo)儀,用于微量樣品比色分析,吸光度值測(cè)定
96 孔酶標(biāo)板:用于比色的孔板(本所贈(zèng)送)
六、檢測(cè)意義:
活性巰基(SH)主要存在于半胱-氨-酸,是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
和生物體內(nèi)某些氧化還原反應(yīng)重要基團(tuán)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中
2 個(gè)巰基脫氫而形成的雙硫鍵,使相鄰多肽得以連接.對(duì)
于維持蛋白質(zhì)完整結(jié)構(gòu)十分重要。所有動(dòng)物組織都含有不
同量的活性巰基,機(jī)體內(nèi)起重要作用的谷-胱-甘-肽,其生理
作用主要是靠所含半胱-氨-酸中活性巰基起還原作用。巰基
還是很多酶活性基團(tuán),一些重金屬鹽如 Hg 2+等與酶巰基結(jié)
合,影響酶活性。巰基化合物與機(jī)體許多機(jī)能活動(dòng),藥物
及毒物的作用以及某些疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。測(cè)
定組織和血液中巰基含量已日益為人們所重視,以期探索
對(duì)某些疾病的發(fā)生機(jī)理、治療、預(yù)防以及預(yù)后判斷等方面
的研究意義。
七、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備:
取一定量的 10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用試劑三 緩沖液
配 制 成 不 同 濃 度 的 標(biāo) 準(zhǔn) 制 作 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(xiàn) : 0mmol/L 、
100μmol/L 、 200μmol/L 、 500μmol/L 、 1000μmol/L 、
2000μmol/L。
微量分型巰基測(cè)試盒