丙二醛（MDA）測試盒（TBA 法）

（貨號:A003-1 TBA 法）

本試劑盒是在國內外眾多測試方法的基礎上改進的一種微量、快速、簡便、準

確、對操作人員健康無損害的測試方法。通過測試可反映出血清（漿）、乳汁等細胞

外液、紅細胞、白細胞、培養細胞以及各種動植物的細胞水平及亞細胞水平的脂質

過氧化物的量。

一、測定意義：

機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂

肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），引發脂質過氧化作用，并因此形成脂質過

氧化物。如：醛基（丙二醛 MDA）、酮基、羥基、羰基、氫過氧基或內過氧基，以

及新的氧自由基等。脂質過氧化作用不僅把活性氧轉化成活性化學劑，即非自由基

性的脂類分解產物，而且通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用。因此，初

始的一個活性氧能導致很多脂類分解產物的形成，這些分解產物中，一些是無害的，

另一些則能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中多不

飽和脂肪酸（PUFA）的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產

物引起細胞損傷。因而測試 MDA 的量常常可反映機體內脂質過氧化的程度，間接

地反映出細胞損傷的程度。

MDA 的測定常常與 SOD 的測定相互配合，SOD 活力的高低間接反應了機體清

除氧自由基的能力，而 MDA 的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程

度，通過 SOD 與 MDA 的結果分析有助于醫學、生物學、藥理及工農業生產的發展。

二、測試原理：

過氧化脂質降解產物中的丙二醛 （MDA）可與硫代巴-比妥酸 (TBA) * 縮合，

形成紅色產物,在 532nm 處有吸收峰。因底物為硫代巴-比妥酸（Thibabituric Acid

TBA）所以此法稱 TBA 法。

三、測試所需儀器設備：

可見光分光光度計或酶標儀，可調到 95℃左右的恒溫水浴箱或沸水鍋，離心機，

10mL 離心管。

四、試劑盒組成與配制(50 管/48 樣 A003-1-1)：

試劑一：液體 10mL×1 瓶，室溫保存。（天冷時會凝固，每次測試前可 37℃加熱

以加速溶解，直至透明方可應用）。

試劑二：液體 6mL×1 瓶，用時每瓶加 170mL 蒸餾水混勻，4℃冷藏。（注意不

要碰到皮膚上）。

試劑三：粉劑×1 支，用時將粉劑加蒸餾水 30mL，加熱到 90℃～100℃充分溶解

后用蒸餾水補足至 30mL，再加冰醋酸 30mL，混勻，配好的試劑避光

冷藏。

標準品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷 5mL×1 瓶，4℃冷藏。

［注］：冰醋酸（分析純，乙酸濃度≥99.5%）；測試盒冷藏至少可保存一年。

五、試劑盒組成與配制（100 管/96 樣 A003-1-2）：

試劑一：液體 20mL×1 瓶，室溫保存。（天冷時會凝固，每次測試前可 37℃加熱

以加速溶解，直至透明方可應用）。

試劑二：液體 12mL×1 瓶，用時每瓶加 340mL 蒸餾水混勻，4℃冷藏（注意不

要碰到皮膚上）。

試劑三：粉劑×1 支，用時將粉劑加蒸餾水 60mL，加熱到 90℃～100℃充分溶解

后用蒸餾水補足至 60mL，再加冰醋酸 60mL，混勻，配好的試劑避光

冷藏。

標準品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷 5mL×1 瓶，4℃冷藏。

［注］：冰醋酸（分析純，乙酸濃度≥99.5%）；測試盒冷藏至少可保存一年。

六、操作步驟：

1、操作表：

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000

轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，

蒸餾水調零，測各管吸光度值。

[注]：a*：表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。

（a*一般取 0.1-0.2mL）

例如樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇、試劑一也取 0.1mL，若樣品取

0.2mL 則標準品、無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正

比曲線，故結果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2只，若樣本不存在

溶血、脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以

免沉淀進入比色皿，影響吸光度。

2、參考取樣量：血清（漿）取 0.1～0.2mL。低密度脂蛋白懸液取 0.1～0.2mL 。食

油取 0.03mL。肝組織、心肌、肌肉組織、螺旋藻等，取 5％或 10%

勻漿 0.1～0.2mL 較好。

3、標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則分光光度計測定標準管吸

光度減去空白管的吸光度為 0.065～0.070（酶標儀測定取 200μl 讀數時為 0.04

左右）。當標準品取樣量為 0.2mL 時，則標準管吸光度減去空白管的吸光度為

0.130～0.140（酶標儀測定取 200μl 讀數時為 0.08 左右）。

4、規范操作方法及簡便操作方法中，若發現檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間

40 分鐘延長至 80 分鐘，但您的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，

以免造成批間差異。

以免沉淀進入比色皿，影響吸光度。

[注 2]：以上規范操作法及簡便操作法適用于人及各種動植物的樣本（包括血清、動

植物組織及體液、細胞及細胞培養液等）。

[注 3]：規范操作方法及簡便操作方法中，若發現檢測樣本吸光度太低，可以將水浴

時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，但您的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至

80 分鐘，以免造成批間差異。

（一）、樣本前處理見實驗方法學中的組織勻漿處理，可制成 10%或 5%的勻漿，

但要注意，因樣本量很少，所以做好的組織勻漿不要離心,例如培養

的細胞等破碎后可以不離心。取樣時注意要搖勻后立即取樣。

（二）、試劑組成與配制：

1、(100 管)微量操作法中的試劑三配制如下：

①、按規范操作方法來配制 MDA 3 號試劑：將 1 支 MDA 3 號粉劑倒入燒杯

內加 90℃～100℃的熱蒸餾水 64mL*，充分溶解（溶解過程中可適當加熱）。

冷卻后加冰醋酸 60mL 混勻。

②、再將上述配好的 MDA 3 號試劑用 50%冰醋酸**按 2:1 進行稀釋，用多少配

多少。例如您需要用微量法測 MDA 需要試劑三為 15mL，則可以取上述按規

范操作法配好的試劑三 10mL 加 50%冰醋酸 5mL，混勻即可。配好的試劑避

光 4℃冰箱冷藏（冰醋酸自備）。

［注］：* 因蒸餾水熱脹冷縮，加熱過程要蒸發，本應加 60mL，現多加 4mL，

冷卻后在 60mL。

** 50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸餾水加 50mL 冰醋酸混合而成的。

*** 冰醋酸又名乙酸，分析純，乙酸濃度≥99.5%。

2、(50 管)微量操作法中的試劑三配制如下：

①、按規范操作方法來配制 MDA 3 號試劑：將 1 支 MDA 3 號粉劑倒入燒杯內

加 90℃～100℃的熱蒸餾水 32mL*，充分溶解（溶解過程中可適當加熱）。

冷卻后加冰醋酸 30mL 混勻。

②、再將上述配好 MDA 3 號試劑用 50%冰醋酸按 2:1 進行稀釋，用多少配多少。

例如您需要用微量法測 MDA 需要試劑三為 15mL，則可以取上述按規范操作

法配好的試劑三 10mL 加 50%冰醋酸 5mL，混勻即可。配好的試劑避光 4℃

冰箱冷藏（冰醋酸自備***）。

［注］：* 因蒸餾水熱脹冷縮，加熱過程要蒸發，本應加 30mL，現多加 2mL，

冷卻后在 30mL。

** 50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸餾水加 50mL 冰醋酸混合而成的。

*** 冰醋酸又名乙酸，分析純，乙酸濃度≥99.5%。

（三）、操作步驟：

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000

轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，

蒸餾水調零，測各管吸光度值。

a*表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。例如

樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇及試劑一也取 0.1mL，若樣品取 0.2mL 則標準品、

無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存

在溶血、脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以免

沉淀進入比色皿，影響吸光度。

注 1 ：用此方法所測各管吸光度值比規范操作方法要高，但不影響最終結果。

注 2 ：5%組織勻漿 a*取 0.1～0.2mL 進行檢測較好。

注③：若發現檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，

但您的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，以免造成批間

差異。

注④：此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則標準管吸光

度減去空白管吸光度為 0.103～0.112。當標準品取樣量為 0.2mL 時，則

標準管吸光度減去空白管吸光度為 0.206～0.224。

(四)、計算公式及舉例：

樣本、試劑一為相同量。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶血、

脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以免

沉淀進入比色皿，影響吸光度。

2、標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則分光光度計測定標準管

吸光度減去空白管的吸光度為 0.065～0.070（酶標儀測

定取 200μl 讀數時為 0.045 左右）。當標準品取樣量為

0.2mL 時，則標準管吸光度減去空白管的吸光度為

0.130～0.140（酶標儀測定取 200μl 讀數時為 0.1 左右）。

旋渦混勻器混勻，離心管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴（或

用鍋開蓋煮沸）80 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，

（3000 轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm

光徑，蒸餾水調零，測各管吸光度值。

a*為樣本取樣量，標準品、無水乙醇、樣本量均相等，生理鹽水的量為樣本的兩

倍，試劑一的量為樣本的四倍。例如高脂血清取 0.1mL，則標準品，無水乙

醇取 0.1mL，生理鹽水取 0.2mL，試劑一取 0.4mL。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶

血、脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中,盡量避免傾倒，以免

沉淀進入比色皿，影響吸光度。

3、標準管參考吸光度：此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL

時，則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸

光度為 0.113～0.122。當標準品取樣量為 0.2mL 時，

則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸光度

為 0.216～0.234。

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開

蓋煮沸）80 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000

轉/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，

蒸餾水調零，測各管吸光度值。

a* 為樣本取樣量，標準品、無水乙醇、樣本量均相等，試劑一的量為樣本的

三倍。例如高脂血清取 0.1mL，則標準品、無水乙醇取 0.1mL，試劑一取

0.3mL。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存

在溶血、脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，

以免沉淀進入比色皿，影響吸光度。

2、標準管參考吸光度：此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL

時，則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸

光度為 0.114～0.123。當標準品取樣量為 0.2mL 時，

則分光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸光度

為 0.216～0.235。

十、紅細胞中的 MDA 檢測方法

（一）、微量紅細胞中的 MDA 檢測方法（樣本量少時用）

1、樣本前處理：（可用以下二種方法中的一種）

（1）、載玻片取全血，進行 MDA 測定：

如果您所需測的血樣很少又很珍貴，例如新生兒指血，或小老鼠的尾血，可采

用載玻片上滴加 1～2 滴肝素涂勻，60oC 以下烤干，或自然吹干。將以上采取的少

量血樣滴在有肝素的載玻片上，用微量加樣器取您所需的血量，再制備成 1︰99 的

溶血液。（即全血︰蒸餾水=1︰99）

（2）、玻璃微量采血管采集紅細胞及溶血液的制備：

①、用 20μl 的玻璃微量采血管取載玻片上的肝素抗凝全血 20μl 左右。將玻璃毛細采

血管置水平位，迅速取下吸球，將空隙長的一端放在酒精燈火焰的三分之一處

燒至透紅，管端變成圓球狀閉結為止。用尺測量并記錄血柱長度 a 厘米。用紙

將采血管卷好，然后將采血管封閉端朝下裝入離心管中，1500 轉/分離心 5～10

分鐘，取出后用小砂輪在血清與紅細胞分界處劃開掰斷（或用剪刀直接剪斷）。

將有紅細胞的開口端倒放入裝有 1mL 蒸餾水的離心管中，再以 1500 轉/分離心

5 分鐘，此時毛細管中的紅細胞沉淀于離心管底部，用鑷子從離心管中取出毛

細管丟棄后，將離心管放在混勻器上旋渦混勻制成溶血液。

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻，然后 3500～4000 轉/分,離心 10 分鐘,（3000 轉

/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，蒸

餾水調零，測各管吸光度值。

a* 表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。例如

樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇、試劑一也取 0.1mL，若樣品取 0.2mL 則標

準品、無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結

果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶

血、脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中,盡量避免傾倒,以免沉淀

進入比色皿,影響吸光度。

規范操作方法標準管吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，則分光光度計測定標準

管吸光度減去空白管的吸光度為 0.065～0.070（酶標儀測定 200μl 讀數時為 0.045

左右）。當標準品取樣量為 0.2mL時，則標準管吸光度減去空白管的吸光度為0.130～

0.140（酶標儀測定 200μl 讀數時為 0.1 左右）。

注：若發現檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，但您

的同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，以免造成批間差異。

②、方法二:（微量法）（用此方法所測各管吸光度值比規范操作方法所得值要

高，但不影響最終結果。）

先將已經按規范操作方法配好的 MDA3 號試劑用 50％的冰醋酸按 2︰1 稀釋，

例如將配好的 MDA3 號試劑 100mL，加 50%的冰醋酸 50mL,混勻。也可以用多少

配多少進行以下檢測。

（注：50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸餾水加 50mL 冰醋酸混合而成的。）

離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，旋渦混勻器混勻，95℃水浴（或用鍋開

蓋煮沸）40 分鐘，取出后流水冷卻,然后 3500～4000 轉/分，離心 10 分鐘，（3000 轉

/分以下離心時間需延長，目的使沉淀）。取上清***，532nm 處，1cm 光徑，蒸

餾水調零，測各管吸光度值。

a* 表示所取的樣品量、標準品量、無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等。例如

樣品取 0.1mL 則標準品、無水乙醇及試劑一也取 0.1mL，若樣品取 0.2mL 則標

準品、無水乙醇及試劑一也取 0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結

果不受影響。

** 一般情況下，標準管、空白管及對照管每批只需做 1～2 只，若樣本不存在溶血、

脂血現象，則對照管可以不測，用空白管來代替對照管。

*** 吸取上清比色時用移液器吸取上清加入比色皿中,盡量避免傾倒，以免沉

淀進入比色皿，影響吸光度。

注：若發現檢測樣本吸光度太低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至 80 分鐘，但您的

同一課題中 MDA 的檢測都必須延長至 80 分鐘，以免造成批間差異。

此方法標準管參考吸光度：當標準品取樣量為 0.1mL 時，分光光度計測定標準

管吸光度減去空白管的吸光度為 0.103～0.112。當標準品取樣量為 0.2mL 時，分

光光度計測定標準管吸光度減去空白管的吸光度為 0.206～0.224。

3、取某濃度的溶血液進行血紅蛋白測定：

Hb 測定：取 100 倍濃縮的 Hb 測試液 1mL (本所有貨供應)，加水至 100mL 配

成應用測試液，取 1：x 血球溶血液 20μl 加稀釋好的 Hb 應用測試液

5mL, 充分混勻，靜置 5 分鐘，波長 540nm, 1cm 光徑，蒸餾水調零，

比色，記錄各管吸光度值。Hb 計算：將吸光度值乘以 367.7 即為

Hb 克數/升。如果血樣量特少時，則樣本量和試劑量均可減少一半

或按比例減少。

4、紅細胞中 MDA 的計算：

在旋渦混勻器上混勻 1 分鐘使細胞充分溶解。

③、抽提：在上述溶血液中加全血體積 2 倍的無水乙醇（0.3mL），(也可用 95%乙醇

代替)在旋渦混勻器上充分混勻 30 秒鐘。

④、沉淀蛋白：再加全血體積 2 倍的三氯-甲烷（0.3mL）置旋渦混勻器上混勻 1 分鐘，

然后 3000～3500 轉/分，離心 5～10 分鐘。此時液體分為三層，上層為 MDA

抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯-甲烷。取上清并記錄體積，約

0.9mL。

丙二醛（MDA）測試盒（TBA 法）