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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒,PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸和磷酸氫離子,蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD +,在340nm測定NADH減少速率,從而計算PEPC活性。

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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

 Phosphorescent Carboxylase,分光光度法 50T/48樣)

一、測定原理

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸

和磷酸氫離子,蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH

生成蘋果酸和NAD +,在340nm測定NADH減少速率,從而計

PEPC活性。

二、自備儀器用品

臺式離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、移液

槍、研缽、冰和蒸餾水

三、試劑組成和配制

提取液:60mL×1 , 4保存

試劑一:30mL×1 瓶,4保存

試劑二:10mL×1 瓶,4保存

試劑三:粉劑×2支,-20保存,臨用前加4mL蒸餾水充分

溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑四:粉劑×1 支,-20保存,臨用前加5mL蒸餾水充分

溶解,用不完的分裝后-20保存(禁止反復(fù)凍融)。

試劑五:原液20μL×1 支,4保存

試劑五:稀釋液10mL×1 瓶,4保存

四、樣品前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心

后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10 4個):提取液體積

mL500-10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入

1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20

200W,超聲3s,間隔10 秒,重復(fù)30 次);在4°C

8000g離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10

比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰

浴勻漿。8000g4離心10min,取上清置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測

五、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長到340nm,用蒸

餾水調(diào)零。

2. 試劑五工作液的配置:將試劑五原液:試劑五稀釋液

=1:329稀釋,用多少配多少。

3. 將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于37°C(哺乳

動物)或25°C(其他物種)預(yù)熱5分鐘。

六、測定意義

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)廣泛存在于動物、植物、

微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化

碳反應(yīng)生成草酰乙酸不可逆反應(yīng)的酶,對三羧酸循環(huán)的運

轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

七、PEPC活性計算

1 血清(漿)活力的計算

單位的定義:每mL 血清(漿)在每分鐘消耗1nmol NADH

定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/mL) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷V÷T

=1624×A

2 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計算

1)按組織蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH

定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/mg) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(Cpr×V)÷T

=1624×A÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為

一個酶活力單位。

PEPC(U/g) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(W×V ÷V樣總)÷T

=1624×A÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol

NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC(U/10 4 cells) = [A×V反總÷(ε×d)×10 9 ]÷(500×V÷V樣總)÷T

=3.248×A

εNADH340nm 處摩爾吸光系數(shù)為6.22×10 3L/mol/cm

d :比色皿光徑(cm),1cm

V反總:反應(yīng)體系總體(L),1010μL=1.01×10 -3L

10 91mol=1×10 9nmol

Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL

V:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL

V樣總:加入提取液體積,1mL

T:催化反應(yīng)時間(min),5min

W,樣本質(zhì)量,(g)。

500 細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性測定試劑盒

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