檸檬酸合成酶(CS)測定試劑盒 生化試劑
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檸檬酸合成酶(CS)測定試劑盒,又稱檸檬酸縮合酶,在三羧酸循環(又稱檸檬酸循環)中有非常重要的作用,因為它催化的反應是關鍵步驟。
檸檬酸合成酶(CS)測定試劑盒
(citroyl synthetase Kit)
一、技術背景:
檸檬酸合成酶,即 citroyl synthetase,又稱檸檬酸縮合酶,
在三羧酸循環(又稱檸檬酸循環)中有非常重要的作用,因
為它催化的反應是關鍵步驟。而三羧酸循環是需氧生物體內
普遍存在的代謝途徑,是三大營養素糖類、脂類、氨基酸代
謝聯系的樞紐和最終代謝通路。
三羧酸循環(英語:Tricarboxylic acid cycle;TCA cycle),
或檸檬酸循環(Citric acid cycle)或克雷伯氏循環(Krebs
Cycle),是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑,因為在這個
循環中幾個主要的中間代謝物是含有三個羧基的檸檬酸,因
此得名;或者以發現者漢斯·阿道夫·克雷伯命名為克雷伯氏循
環,簡稱克氏循環(Krebs cycle)。三羧酸循環是三大營養素
(糖類、脂類、氨基酸)的最終代謝通路,又是糖類、脂類、
氨基酸代謝聯系的樞紐。
在三羧酸循環中,反應物葡萄糖或者脂肪酸會變成乙酰
輔酶 A。這種“活化醋酸"(一分子輔酶和一個乙酰基相連),
會在循環中分解生成最終產物二氧化碳并脫氫,質子將傳遞
給輔酶煙-酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和黃素腺嘌呤(FAD),
使之成為 NADH + H+和 FADH2。NADH + H+和 FADH2 會
繼續在呼吸鏈中被氧化成 NAD+和 FAD,并生成水。這種受
調節的“燃燒"會生成 ATP,提供能量。
真核生物的線粒體和原核生物的細胞質是三羧酸循環的
場所。它是呼吸作用過程中的一步,但在需氧型生物中,它
先于呼吸鏈發生。厭氧型生物則首先遵循同樣的途徑分解高
能有機化合物,例如糖酵解,但之后并不進行三羧酸循環,
而是進行不需要氧氣參與的發酵過程。
在三酸酸循環第一步反應中,催化乙酰輔酶 A 的乙基與
草酰乙酸的酮基結合生成檸檬酰輔酶 A,以便后續高能硫酸
鍵水解,釋放出輔酶 A,得到檸檬酸。檸檬酸合成酶是一個
調控酶,此酶的底物乙酰輔酶 A 和草酰乙酸是它的激活劑,
NADH、琥珀酰輔酶 A 是抑制劑。
三、所需儀器:
酶標儀(412nm)、微量移液器、漩渦混勻器、高速離心
機、37℃水浴/氣浴箱、臺式離心機、研缽或高速組織分
散器(勻漿機)、冰、雙蒸水、離心管(1.5mL 或 2mL)。
四、試劑組成及配制:(A108-1-1 20T)
㈠、前處理試劑:
提取液 20mL×1 瓶,4℃保存。
沖洗液 50mL×1 瓶,4℃保存。
㈡、反應試劑:
試劑一:緩沖液 4mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:底物液 0.6mL×1 支,-20℃避光保存。
試劑三:顯色劑 0.6mL×1 支,-20℃避光保存。
試劑四:陰性對照液:0.2mL×1 支,4℃避光保存。
五、試劑組成及配制:(A108-1-2 50T)
㈠、前處理試劑:
提取液 50mL×1 瓶,4℃保存。
沖洗液 100mL×1 瓶,4℃保存。
㈡、反應試劑:
試劑一:緩沖液 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:底物液 1.4mL×1 支,-20℃避光保存。
試劑三:顯色劑 1.4mL×1 支,-20℃避光保存。
試劑四:陰性對照液:0.5mL×1 支,4℃避光保存。
六、試劑盒存放:
本.試.劑.盒.收.到.后.按.規.定.條.件.存.放.,.有.效.期.6.個.月.。.
七、友情提醒:
本試劑盒內所有試劑僅限于科學研究使用,不得用于臨
床診斷及藥物治療等。
八、操作步驟:
1、樣本前處理:
A)方法一:液氮研磨
①、樣本準備:取出新鮮組織或冷凍組織(4℃解凍或室
溫解凍),用沖洗液沖洗干凈,濾紙吸干,準確稱取
組織重量 100~300mg,加入液氮,快速用研磨棒碾
碎組織成粉末狀,備用。
②、10%待測懸液制備:取研磨后組織粉末稱重置于離
心(1.5mL 或 2mL)管中,并按重量(g):體積(mL)=1:
9 的比例加入 9 倍體積的提取液,渦旋混勻器劇烈
混勻 30 秒,間隔 2 分鐘,重復操作 2~3 次,制備
10%待測懸液。放回冰槽環境回溫。
③、離心處理:將裝有 10%待測懸液的離心管置于 4℃
臺式離心機,10000 轉/分鐘,離心 10 分鐘。
④、10%待測上清制備:取出離心管置于冰槽環境,小
心吸取 10%待測上清液轉移到新離心管(1.5mL 或
2mL)待測,同時用考馬斯亮藍試劑(或 BCA 試劑)
測定蛋白濃度(本所有售)。
B)方法二:機械勻漿(如不具備液氮操作條件)
①、10%待測懸液制備: 取出新鮮組織或冷凍組織(4℃
解凍或室溫解凍),用沖洗液沖洗干凈,濾紙吸干;準
確稱取組織重量,按重量(g):體積(mL)=1:9 的比
例,加入 9 倍體積的提取液,冰水浴條件下機械勻
漿,制備成 10%待測懸液。
②、離心制備 10%待測上清:10000 轉/分,離心 10 分鐘,
吸取上清即為 10%的待測上清液。同時用考馬斯亮
藍試劑(或 BCA 試劑)測定組織蛋白濃度。
2、操作步驟:
⑴、儀器準備:
將酶標儀設定到待測波長(412nm),預溫 30min,
使之各項指標參數處于較穩定使用狀態。
⑵、試劑準備:
將冷凍試劑(底物液、顯色劑)與冷藏試劑(緩沖
液、陰性對照液)取出,平衡至室溫后使用。
⑶、樣本準備:
將待測樣本置于冰槽回溫平衡后待測。
⑷、反應步驟(96 孔板操作):(附贈 96 孔板 1 塊)
a、取干凈無菌 96 孔酶標板,置于試驗臺水平放置
并標記待測樣本編號,即 U 孔(或陰性對照孔,
即 O 孔);
b、加入試劑一(緩沖液)190μL 于 96 孔酶標板 U
孔(或 O 孔)中;
c、加入試劑二(底物液)25μL 于上述 U 孔(或 O
孔)中;
d、加入試劑三(顯色劑)25μL 于上述 U 孔(或 O
孔)中;
e、將加入上述試劑 96 孔酶標板輕搖混勻并置于
37℃孵育箱 3~5min;
f、取出裝有預溫試劑的 96 孔酶標板,水平置于試
驗臺;
g、加入待測樣本 10μL 于上述 U 孔中(或陰性對
照液 10μL 于 O 孔中)(待.測.樣.本.須.澄.清.,.凍.存.
后.復.溶.樣.本.據.情.況.需.離.心.除.去.析.出.蛋.白.后.再.
用.);
h、輕搖該酶標板,使待測樣本(或陰性對照液)
與預溫試劑充分接觸;并將該操作 96 孔酶標板
轉入酶標儀,波長 412nm,測定待測樣本吸光
度 OD 值,記為 AU0(陰性對照孔為 AO0);
i、將該 96 孔酶標板轉入 37℃孵育箱(或者在 37℃
恒溫酶標儀)中溫浴 15min;
j、再將該操作 96 孔酶標板轉入酶標儀,波長
412nm,測定待測樣本吸光度 OD 值,記為 AU15
(陰性對照孔為 AO15);;
k、待測樣本值(U 孔):待測樣本吸光度 AU15— 待
測樣本吸光度 AU0。
【陰性對照值(O 孔):AO15-AO0】
檸檬酸合成酶(CS)測定試劑盒